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（3）QIAamp Viral RNA MiniキットによるRNAの抽出（本研究でもこの方法を採用した）
RNAの抽出には多くの方法があり、また抽出キットも多数市販されている。それぞれが良いと判断した方法を用いて良い。ここではQIAamp Viral RNA Miniキットを用いる方法を紹介する。本研究でもこのキットを用いた。
QIAamp Viral RNA MiniキットはCarrier RNAが含まれており、RNA抽出効率が高いが、上述のようなサンプルの調製が必要となる。またこのキットにはDNase処理が含まれていないので、各自が行わなければならない。
1）使用前に行う試薬の調製
サンプルを室温（15〜20℃）に戻す。
Buffer AW1（Kit Cat.No.51104）に96〜100%エタノールを25ml加える。BufferAW2（Kit Cat.No.51104）に96〜100%エタノールを30ml加える。
Carrier RNA（凍結乾燥品）のチューブにBuffer AVL 1ml添加しCarrier RNAを完全に溶解させ、Buffer AVLに全量を添加する。添加したBuffer AVL/Carrier RNAは室温で2週間、2〜8℃で6カ月間安定である。Buffer AVL/Carrier RNA中に沈殿物がある場合には、加熱（80℃）により溶解する。ただし、加熱は5分間以内とし、6回以上の加熱は行わないこと。Buffer AVL/Carrier RNAは使用前に室温に戻す。
2）操作法
以下の操作は室温で行う。
（1）1.5mlチューブにBuffer AVL/Carrier RNA 560μlを入れる。
（2）マガキ抽出上清（10,000rpm，10分間）を140μl（増量することも可能である。詳細はキットの添付マニュアルを参照）を入れ、サンプルとBufferを充分混合するため15秒間Vortexにかけ、室温（15〜25℃）に10分間置く。チューブをスピンダウンする。
エタノール（96〜100%）560μlをチューブに加え、15秒間Vortexをかけた後、チューブをスピンダウンする。液が混濁した時には9,000×g（10,000rpm）で5分間遠心する（リアルタイムPCRを行うときにはこの遠心を行ったほうが良い）。
（3）（2）の液630μlをQIAampスピンカラム（2mlコレクションチューブに注入し、蓋を閉め、6,000×g（8,100rpm）で1分間遠心する。QIAampスピンカラムを新しい2mlのチューブに移し、残りの（2）の液630μlを入れ、同様に遠心し、全ての液が無くなるまで行う（サンプル量が140μlのときには、この操作が2回で終わる）。
（4）QIAampスピンカラムを開け、Buffer AW1 500μlを入れる。
（5）蓋を閉め、6,000×g（8,100rpm）で1分間遠心する。QIAampスピンカラムを新しい2mlのチューブに移し、ろ液の入っているチューブは捨てる。
（6）QIAampスピンカラムにBuffer AW2 500μlを加え、20,000×g（14,000rpm）で3分間遠心する。Buffer AW2とろ液等が接触した時には（7）を行う（このような事は通常起きない）。
（7）QIAampスピンカラムを新しい2mlのチューブに移し、ろ液の入っているチューブは捨てる。フルスピードで1分間遠心する。
（8）QIAampスピンカラムを新しい蓋つき1.5mlのチューブに移し、ろ液の入っているチューブは捨てる。QIAampスピンカラムの蓋を開け、室温に戻したBuffer AVE 60μlを加え、蓋を閉めて1分間置いた後、6,000×g（8,100rpm）で1分間遠心する。
（9）このろ液が抽出RNAであり、抽出RNAは-80℃での保存が望ましいが、-20℃以下で1年間は安定である。
（4）DNase処理
二枚貝抽出液中には様々なDNAが含まれており、しばしばPCRで非持異バンドが出現するので、それらを抑制するため、DNase処理を行う。またそうすることで、この時点までにDNAの混入が起きた時でも、それらを消化することができる。したがって、キットにDNase処理が含まれていない時にはこの操作を行うことが望ましい。
注意としてDNase Iを使用するマイクロピペットは専用のものを用い、可能であればオートクレーブができるものが良い。検査終了後、使用したDNaseの含まれている液、チューブは高圧滅菌にかける。
（1）次に示したようにDNase処理混合液の調製を行う。
DNase処理混合液
| 試薬 |
15μl系 |
30μl系 |
| 抽出RNA |
12.0μl |
24.0μl |
| 5×First-Strand Buffer 注1） |
1.5μl |
3.0μl |
| Distilled water |
0.5μl |
1.0μl |
| DNase I（1U/μl） |
1.0μl |
2.0μl |
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（2）混合液調製後、37℃に30分間置く。
（3）次いで75℃に5分間置く。
（4）直ちにon ice（または4℃）する。これがDNase処理済み抽出RNAである。
（5）RT反応（Super Script II RT (Invitrogen) を用いる時）
（1）次のRT反応調整液を作製する。
RT反応液調製液（Super Script II RTを用いる時）
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15μl系 |
20μl系 |
30μl系 |
50μl系 |
| DNase 処理RNA |
7.5μl |
10.0μl |
15.0μl |
30.0μl |
| 5X SSII Buffer |
2.25μl |
3.0μl |
4.5μl |
7.0μl |
| 10mM dNTPs |
0.75μl |
1.0μl |
1.5μl |
2.5μl |
| Random Primer（1.0μg）注2） |
0.375μl |
0.5μl |
0.75μl |
1.25μl |
| Ribonuclease Inhibitor（33unit/μl） |
0.5μl |
0.67μl |
1.0μl |
1.67μl |
| 100mM DTT |
0.75μl |
1.0μl |
1.5μl |
2.5μl |
| Super Script II RT（200u/μl） |
0.75μl |
1.0μl |
1.5μl |
2.5μl |
| Distilled water |
2.125μl |
2.83μl |
4.25μl |
2.58μl |
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（2）反応は42℃で30分から2時間行う（通常1時間）。
（3）次いで99℃で5分間加熱し、on ice（または4℃）する。
（6）1st PCR
1）1st PCRは、ノロウイルスについては次の混合液を作製する（G1とG2を別々に作製する）
ノロウイルス
1. Distilled water 33.75μl
2. 10×Ex TaqTM buffer 5.0μl
3. dNTP（2.5mM）4.0μl
4. NV プライマーF（25μM）1.0μl
5. NV プライマーR（25μM）1.0μl
6. cDNA (Templete) 5.0μl
7. EX Taq (5unit/μl) 0.25μl
Total 50.0μl
1st PCRに用いるプライマーは、食品のときには、G1ではCOGlF/G1-SKR、G2ではCOG2F/G2-SKRおよびALPF/G2AL-SKR（アルファトロン型を検出するプライマー、この2組のプライマーは混合して用いても良い）を、ふん便材料の時にはG1ではG1-SKF/G1-SKR、COG1F/COG1Rを、G2では
G2-SKF/G2-SKR、G2-SKF/G2AL-SKR、COG2F/COG2R、ALPF/COG2Rを用いることが望ましい。
ただし、このほかのプライマーを用いてもよい。例えばポリメラーゼ領域のプライマーなど。
2）PCR反応
増幅は94℃、3分を1サイクル、94℃、1分、50℃、1分、72℃、2分を40サイクル、72℃、15分を1サイクルで行う。増幅条件はプライマー、サーマルサイクラーによって若干異なることもあるので、それぞれ最適な条件で行うと良い。
3）電気泳動
PCR産物8μlと5× Loading buffer 2μlを混合し、1.5%アガロースゲルを用いて泳動する。泳動bufferはTAEを使用する。
4）アガロースゲル染色
泳動後ゲルをエチジウムブロマイド染色液（TAE溶液100mlにエチジウムブロマイド10mg/mlのものを10μl加えた溶液）に20分間入れておく。この時に緩やかに揺すると良い。
5）写真撮影、バンドの確認
染色したゲルはUV照射で写真撮影し、バンドの確認を行う。食品（二枚貝抽出液のこと）では1stPCRでバンドが見られなかった時には（多くの例では見られない）、次にNested PCRを行う。
注1）：使用するReverse Transcriptaseのbufferを用いる。
注2）：Random Primerの代わりにNV プライマー、ポリオ2プライマーを用いても良い。
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