mlを作製した。この培地をアガープレート作製器によりシャーレ1枚につき30mlずつ分注してプレートを作製した。
3．1．4 軟寒天とトップアガーの作製
塩化ナトリウム4g、寒天4.8gおよび精製水より軟寒天800肋を作製し、滅菌した後、使用時まで約45℃のドライパスで保温した。
使用直前に、TA100，TA1535，TA98，TA1537菌株の場合には、軟寒天と0.5mMのD-ビオチンおよび0.5mMのL-ヒスチジンの水溶液を容量比でl0：1に混合し、ドッブアガーを作製した。WP2uwAの場合には、軟寒天と0.5mMのL-トリプトファン水溶液を容量比で10：1に混合し作製した。
3．1．5 S9mixの調製2．5項のS9を1mlとCofactor-1 9mlを加えS9mixを作製した
3．1．6 プレートの識別と使用枚数
予めプレートに試験菌株の種類（TA100は1，TA1535は5，WP2uvrAはW，TA98は9，TA1537は7）と試験の種類（直接法は-、代謝活性化法は+）および被験液濃度（高い方から、1，2，3...）の識別を記載した。
試験に使用するプレート枚数は、陽性対照と陰性対照では、濃度設定試験および本試験とも、各菌株ごと、S9mixの有無ごとにそれぞれ3枚使用した。
各被験液では、濃度設定試験および本試験とも、各菌株ごと、Sgmixの有無ごとにそれぞれ2枚使用した。
3．1．7 前培養
前培養条件は、温度37℃振とう培養恒温水槽中で100回/分、9時間培養した。
3．1．8 無菌試験
無菌試験は、被験液、S9mix、滅菌精製水について行った。
3．2 プレート法による試験手順
3．2．1 直接法（-S9mix）
滅菌された試験管に被験液0.1肋を取り、これに0.1MのNa-リン酸緩衝液（pH7−4）を0.5ml入れた。この試験管に前培養した試験菌株懸濁液0.1mlを加え、さらに、トップアガー2mlを加えてアワが生じないように混和後、プレート上に注ぎ、一様に広げて遮光した。このプレートを37℃のフラン器に入れ、濃度設定試験、本試験とも67時間培養した。培養後、プレート上の試験菌株の生育阻害の有無を実体顕微鏡を用いて調べ、復帰突然変異により生じたコロニー数を数えた。
